I det seneste årti har nye teknikker gjort det muligt at identificere og producere hundredetusinde nye mulige lægemiddelsubstanser hvert år. Sammenfaldende for disse potentielle lægemidler er, at de har en farmakologisk effekt, dvs. at de kan hæmme, lindre eller måske kurere sygdomme og/eller sygdomssymptomer. Desværre viser studier, at mange substanser optages dårligt fra tarmen til blodbanen. De kan derfor ikke anvendes i produktionen af medicin i form af tabletter eller kapsler, hvilket ellers er den måde de fleste patienter foretrækker at indtage medicin på.

For at kunne forudsige hvorvidt et potentielt lægemiddel vil blive absorberet eller ej, kræves der nye beregningsmetoder, samt kapacitet til at behandle store mængder data.

I sin afhandling præsenterer hun teoretiske modeller for at studere både lægemidlers opløselighed i tarmen og lægemidlers optagelse gennem tarmvæggen – egenskaber som er afgørende for, hvor meget af et lægemiddel kroppen optager. Formålet har været at udvikle nye, hurtige og billige metoder til at udskille de substanser som absorberes godt i tarmen. De databaserede modeller rangordner substanserne efter deres absorberingsegenskaber på et tidspunkt, hvor lægemidlet endnu blot eksisterer som idé og ikke som en færdig substans. Substanser med lovende absorberingsegenskaber kan derefter fremstilles kemisk. Derved arbejder man kun videre med substanser, som har potentiale til at blive videreudviklet til et færdigt produkt.

Resultatet viser, at det er meget vigtigt at basere datamodeller på eksperimentelle data af høj kvalitet, eftersom de teoretiske modeller aldrig bliver bedre end de data, som de baseres på. Det er også vigtigt, at mange forskellige typer stoffer indgår ved udviklingen af modellerne således, at de bliver så generelle som muligt. Christel Bergström viser, at man kan anvende enkle databaserede modeller til at forudsige opløsnings-og optagelsesegenskaberne hos et lægemiddel. De modeller som præsenteres i afhandlingen kan resultere i, at nye lægemidler udvikles mere effektivt og med lavere udgiftsniveau, hvilket igen fører til billigere lægemidler for patienten.

Datamodeller som bygger på viden om molekylers egenskaber, kan forudsige et lægemiddels evne til at opløses i tarmen og lede til mere effektive og billigere fremstillingsmetoder. Det viser Christel Bergström, Institut for Farmakologi, Uppsala Universitet, i sin afhandling. Christel Bergströms arbejde vil kunne spare dyreliv og – lidelse.

Alternativer til dyreforsog
Som alternativ til dyreforsøg findes der idag en færdigudviklet celledyrkningsmetode til afprøvning af f.eks. lægemidlers optagelse i tarmen. Metoden indebærer, at man dyrker humane tarm-celler på et porøst underlag. Cellerne vokser og danner en "måtte" af celler med en yderside (ind mod tarmens hulrum = tarmens inderside) og en inderside (ind mod kroppen = tarmens yderside). Forskellige former for lægemidler tilføres celle "måtten", og de absorberes nu på samme måde, som de ville gøre via tarm-epithelet på et menneske eller et dyr.
Celledyrkningsmetoden er udviklet af en gruppe forskere under ledelse af professor Per Artursson ved BMC (Biomedicinsk Centrum) i Uppsala. Arbejdet er sket med bidrag fra bl.a. den svenske Stiftelsen Forskning utan djurförsök.
Metoden med at dyrke tarmceller til brug ved testning af nye lægemidler er nu færdigudviklet og accepteret som afprøvningsmodel af medicinalfirmaer i Sverige. Det giver en meget stor reduktion af forsøgsdyr.
Tarm-epithelcellerne slipper ikke et hvilket som helst stof igennem men fungerer på sin vis som en beskyttelsesbarriere mod stoffer, der opfattes som fremmede eller skadelige. Det er naturligvis en fordel, eftersom det giver en beskyttelse mod optagelsen af giftige stoffer.
Ved visse lægemidler kan det dog være en ulempe. Et lægemiddel, som feks, insulin, kan på nuværende tidspunkt kun tilføres kroppen ved injektion. Det ville være en stor fordel, hvis det kunne tages i tabletform, men her træder tarmepithelets forsvarsmekanisme til og "nægter" at lade det insulinlignende lægemiddel slippe igennem.
Professor Per Artursson og hans forskergruppe anvender denne nye model til at undersøge, om man på en eller anden måde kan "snyde" tarmbarrieren, så den lader et lægemiddel slippe igennem som ellers ville blive afvist. Man har nemlig fundet frem til forskellige måder, hvorpå man kan åbne sammenføjningerne mellem cellerne, så lægemiddelmolekylerne kan slippe igennem. Hvis man får nogle konkrete positive resultater ud af disse forsøg, vil man i fremtiden kunne give tabletter som erstatning for injektioner til eksempelvis sukkersygepatienter.
Arbejdet med at finde frem til nye, forbedrede metoder til afprøvning af absorption fortsætter. Man arbejder nu med at udvikle et dataprogram indeholdende data fra celledyrkningsmodellen. Nye lægemidler kan fremover undersøges i en tidlig screening ved hjælp af programmet.

Kroppens optagelse af forskellige stoffer
Den mad vi spiser eller det lægemiddel vi indtager gennem munden sønderdeles først mekanisk af tænderne, siden rent kemisk af forskellige fordøjelsesvædsker og når så efterhånden tyndtarmen. På dette tidspunkt er maden så findelt, at den er i molekyleform. Optagelsen sker hovedsageligt gennem tyndtarmsvæggen. Molekylerne passerer gennem tarmvæggen og optages af de blodkar, der omgiver tarmen. Med blodet føres stofferne derefter til forskellige dele af kroppen.
Indersiden af tyndtarmen er beklædt med "tarmluv", som giver tarmens inderside et fløjlsagtigt udseende. Den består af små tråde eller tappe, som på latin kaldes villi. Tappene gør, at tarmens overflade bliver meget større, end hvis tarmvæggen var glat, og på den måde øges absorptionsevnen. Tyndtarmens inderside er beklædt med et lag tarm-epithelceller (tappene), som langs siden har små børster. Disse børster (mikrovilli) er så små, at de ikke kan skelnes i et almindeligt mikroskop men alene i et elektronmikroskop.
Absorptionen sker "udefra" (d.v.s. fra tarmens hulrum) og "indad" (d.v.s. ind i kroppen) gennem de mikrovilli, som tarm-epithelcellerne er forsynet med.

Absorptionstest
Èn af de ting man undersøger inden et lægemiddel kommer i handelen er, hvorledes lægemidlet optages i kroppen. Et middel kan have nok så gode egenskaber, men hvis det ikke optages (absorberes) i kroppen, er det ubrugeligt som lægemiddel.
Denne testning af absorption sker almindeligvis på forsøgsdyr, men der findes nu alternativer, som kan nedbringe antallet af dyreforsøg eller helt erstatte dem.
For at forstå, hvorledes alternativet fungerer, vil jeg først give en kort gennemgang af, hvorledes forskellige stoffer absorberes af kroppen.

Tre alternative metoder til dyreforsøg til test af kemiske stoffer eventuelle giftvirkninger er blevet valideret af ECVAM (Europa-Kommissionens Center for Validering af Alternative Metoder). Begrebet validering dækker, at resultater opnået med en alternativ metode bliver sammenlignet med resultater fra dyreforsøg i en ringtest, hvor flere laboratorier deltager. De alternative metoder er blevet godkendt af alle EU's medlemsstater, og testene er netop blevet optaget i et bilag til EU's direktiv om klassificering og mærkning af kemiske stoffer. Derfor indgår de tre alternative tests nu i alle EU landenes kemikalielovgivning.

Testpakken omfatter tre metoder, hvor de to første kan bruges til bedømmelse af hudætsning, og den sidste kan bruges til vurdering af, om et stof bliver giftigt ved lyspåvirkning:
· måling af elektrisk modstand i hud fra rotter,
· måling af celledød i vævsmodel med hudceller fra mennesker, og
· måling af celledød efter lyspåvirkning (fototoksicitet)

ÆTSNING
I henhold til kemikalieloven skal stoffer og produkter klassificeres som ætsende, når de på et dyrs ubeskadigede hud har fremkaldt dybgående vævsdød ved prøvning for hudirritation eller dette har kunnet forudsiges. Ætsende stoffer mærkes i EU som alvorligt hudætsende (R35 - ætsning indenfor 3 minutter) eller hudætsende (R34 - ætsning indenfor 4 timer) (1).
De internationalt gældende normer for afprøvning af ætsende effekter (2, 3) har hidtil været baseret på potentielt stærkt lidelsesvoldende forsøg med kaniner.
Det er dog en forudsætning for gennemførelse af kaninforsøget, at ætsende stoffer først sorteres fra ved brug en række alternative metoder. Dyreforsøget skal i henhold til normen ikke udføres for stoffer, der kan forudsiges at være ætsende udfra deres kemiske struktur, fysisk-kemiske egenskaber ( f.eks. stærkt sure eller stærkt basiske stoffer) eller på grundlag af resultater fra test i velvaliderede in vitro metoder for ætsning.

Den lidelsesvoldende testning for ætsende effekt
kan nu erstattes af en alternativ metode

Hverken den internationale lovgivning om dyreforsøg eller de internationalt accepterede normer har hidtil kunnet sætte et effektivt stop for, at ætsende stoffer er blevet testet i forsøg med ubedøvede dyr. Optagelsen af de nye alternative testmetoder i EU's kemikalielovgivning er derfor et stort fremskridt, der cementerer forbuddet mod stærkt lidelsesvoldende dyreforsøg med ætsende stoffer. De alternative metoder kan begge anvendes til at skelne mellem stoffer, der er kendt for at være ætsende for hud, og stoffer, der er kendt for ikke at være det. Vævsmodellen kan tillige bruges til at afgøre, om ætsende stoffer skal mærkes med R34 eller R35.

Måling af elektrisk modstand i hud fra rotter
Testen er udviklet af en engelsk forskergruppe. Gruppen har opnået en god forudsigelse af ætsende effekter af mere end 200 kemiske stoffer ved at bruge hud fra laboratorierotter, og den har også udviklet en tilsvarende test med isoleret hud fra mennesker. ECVAM har valideret testen med rottehud i en ringtest med 60 stoffer i 2 laboratorier.
Testen med rottehud bygger på, at ætsende stoffer beskadiger hudens hornlag. Dette medfører en svækkelse af hudens barrierefunktion, hvilket kan måles som en reduktion af hudens naturlige elektriske modstand. Hvis et stof er ætsende, falder hudens modstand til under en bestemt grænseværdi (5 kW).
Til fremstilling af hudlapper anvendes 20-23 dage gamle laboratorierotter. Hårene på ryggen og flanken fjernes med en lille dyresaks. Dyrene vaskes dernæst omhyggeligt, idet det pågældende hudområde holdes neddyppet i en opløsning af antibiotika. Forsøgsdyrene vaskes igen med antibiotika på tredje- og fjerdedagen efter den første vask og skal derefter anvendes inden tre dage. Forsøgsdyrene aflives derefter, og ryghuden fjernes. Huden anbringes for enden af et rør, og en gummiring sættes tætsluttende omkring rørets ende for at holde huden på plads. Røret fastholdes ved hjælp af fjederklemmer i et væskefyldt kammer (se figur 1).

Teststoffer skal være i kontakt med hudlappen i 24 timer. Kemikaliet fjernes derefter ved spuling under vandhane. Der anbringes elektroder på hver sin side af hudlappen, og den elektriske modstand i huden måles. Er modstanden mindre eller lig med 5 kW betragtes stoffet som ætsende. Overfladeaktive stoffer eller neutrale organiske stoffer kan dog give falsk positive resultater i testen. Her bør det tillige undersøges i hvor høj grad et farvestof kan trænge ned i vævet.
En begrænsning ved testen med rottehud er, at der skal bruges laboratoriedyr. Det vil helt kunne undgås, hvis testen udføres med isoleret hud fra mennesker eller med svinehud fra slagterier. Overskydende hud fra kosmetiske operationer kan anvendes, men tilgængeligheden af denne type væv er stærkt begrænset. En stor mængde videnskabelig dokumentation tyder dog på, at testen også vil kunne udføres ved brug af svinehud.

Måling af celledød i vævsmodel med hudceller fra mennesker
Den anden alternative metode til måling af ætsning bygger på, at der bruges hudceller fra mennesker til opbygning af kunstigt hud. Celler fra overhuden sås ud på egnet overflade. Efter få ugers dyrkning i laboratoriet dannes et hudvæv med et funktionelt hornlag (se figur 2). Kunstig hud af denne type bliver brugt ved behandling af brandsårspatienter, men vævet kan også anvendes ved test af mange typer af giftvirkninger. I dette tilfælde bruges vævet til påvisning af stoffers ætsende effekter helt uden brug af forsøgsdyr. Vævsmodeller af denne type fremstilles og sælges til laboratorier verden over af forskellige firmaer i Europa og i USA. ECVAM har valideret ætsningstesten med to vævsmodeller af denne type i to ringtests, hvor 24 til 60 modelstoffer blev testet i 2 til 3 laboratorier.

Ved udførelsen af testen påføres teststoffet i op til 4 timer på overfladen af et kunstigt væv af menneskelige hudceller med et fungerende hornlag. Ætsende stoffer nedsætter cellernes levedygtighed til under en fastlagt grænseværdi. Testen bygger på, at kemikalier er ætsende, når de er i stand til at trænge gennem hudens hornlag, og samtidig fremkalder celledød i de underliggende vævslag.
Vævet skal have et fungerende hornlag med et underliggende lag af levende celler. Hornlagets barrierefunktion må være tilstrækkelig. Dette kan vises ved, at hudmodellen ikke påvirkes af stoffer, der er giftige for celler, men som ikke almindeligvis passerer hornlaget. De levende celler i vævet skal være tilstrækkelig levedygtige til, at der kan skelnes klart mellem positive og negative kontrolstoffer. Teststoffer påføres således at hudoverfladen dækkes. Efter 4 timer vaskes teststoffet omhyggeligt vaskes af hudoverfladen med fysiologisk saltvand. Herefter måles cellernes levedygtighed med en farvemetode.

FOTOTOKSICITET
Et kemisk stof kan blive giftigt efter bestråling med UV-lys eller synligt lys. Dette kaldes fototoksicitet. Det kan dreje sig om en giftvirkning, der fremkaldes på huden, efter at den har været udsat for bestemte kemiske stoffer og derefter for lys. Men der kan også være tale om en giftvirkning, der fremkaldes ved bestråling af huden efter en indtagelse af et kemisk stof, der påvirker hele organismen. Fototoksicitet er en bivirkning, der er kendt for at kunne opstå ved brug af visse lægemidler og visse kosmetiske produkter.

Måling af celledød efter lyspåvirkning
En in vitro test for fototoksicitet er blevet udviklet og valideret i et fælles projekt med ECVAM og COLIPA (den europæiske kosmetikindustri). I testen bruges der bindevævsceller fra mus (3T3 celler). Anvendelsen af cellemetoden kræver ikke brug af forsøgsdyr. Cellerne påvirkes med det kemiske stof, der skal undersøges. Nogle cellekulturer bestråles herefter med UV-lys, medens andre ikke bestråles. Giftvirkningen for cellerne bedømmes ved måling af deres optagelse af farvestoffet neutralrødt. Levende celler optager farven, mens døde celler forbliver farveløse. Forskellen i giftvirkning mellem bestrålede og ubestrålede kulturer opgøres. Stoffet bedømmes som akut fototoksisk, hvis denne forskel overstiger en bestemt grænseværdi.
Resultater fra in vitro fototoksicitetstesten blev sammenlignet med akutte fototoksicitets/fotoirritations-virkninger på dyr og mennesker. Testen viste sig egnet til at forudsige disse virkninger for 30 modelstoffer. 10 laboratorier deltog i testningen. Testen er ikke beregnet til påvisning af stoffer, der kan fremkalde allergi eller kræft på grund af en kombineret virkning af et kemisk stof og lys. In vitro testen kan heller ikke bruges til vurdering af styrken af fototoksicitet.
Tidligere har der ikke været lovkrav om, at kemikalier skal test for fototoksicitet. In vitro metoden for fototoksicitet erstatter derfor ikke et lovpligtigt dyreforsøg. Faktisk er situationen den, at både in vitro metoden og et dyreforsøg for fototoksicitet er på vej til at blive optaget i de internationale normer for testning af kemiske stoffer i OECD landene.

1. Bekendtgørelse om klassificering, emballering, mærkning, salg og opbevaring af kemiske stoffer og produkter. Miljø- og Energiministeriets bekendtgørelse nr. 801 af 23 oktober 1997.
2. OECD guideline for testing of chemicals. 404. Acute dermal irritation/corrosion. OECD, Paris, 1992.
3. OECD guideline for testing of chemicals. 405. Acute ocular irritation/corrosion. OECD, Paris, 1987.

LAL-test er en forkortelse af Limubes amoebocyte lysate test. Testen anvendes, fordi man har fundet ud af, at blod fra dolkhaler, Limulus polyphemus, koagulerer, når det kommer i berøring med endotoxin*. LAL er et ekstrakt af dolkhalens blodceller (amoebocyter eller amøbocyter).
Testen udføres ved, at en lille del af det emne man ønsker testet og en tilsvarende lille mængde blodekstrakt blandes i et reagensglas. Hvis der findes endotoxiner i emnet, dannes der en klump af koaguleret blod i glasset.
LAL-testen er mere nøjagtig end kanin-testen. Den er også billigere, enklere og mere pålidelig. Testen er accepteret af myndighederne i USA, men i Danmark henvises der til Den Europæiske Farmakopé og her nævnes under afsnittet "Pyrogener" udelukkende testmetoden med brug af kaniner - LAL testen nævnes ikke med ét ord.

Dyretests
Ifølge Den Europæiske Farmakopé skal pyrogentesten udføres ved afprøvning af bl.a. hemodialysevædsker og ved forskellige lægemidler, der gives som injektio ner eller i fast form. Når der i Farmakopéen foreskrives pyrogentest, tales der udelukkende om kanintesten, ikke om alternativer.

Træge myndigheder
Et sørgeligt faktum er, at myndighederne er meget træge, når det gælder godkendelsen af alternativer, som kan erstatte tests med brug af dyr - selv når det gælder alternativer, som er godkendt som brugbare. Glædeligt er det dog, at hvis et alternativ er enklere eller billigere end en dyretest, så er de relevante firmaer ofte selv så interesserede i at bruge dem, at de også får myndighederne til at acceptere dem, selvom det pågældende alternativ ikke er medtaget i forskrifterne.

Udryddelsestruet
Da LAL-testen blev udviklet, og man begyndte at bruge den, fiskede man så store mængder dolkhaler op af havet, at der var fare for, at de blev helt udryddede. Nu fisker man dolkhalen op, tapper en del blod fra den og sætter den ud i havet igen. Men også her kan der være lidelser for dyret, ligesom ved brugen af kaninen. Hvorledes tappes blodet? Hvor meget? Hvordan har dyret det efter tapningen?

LAL-testen er et eksempel på en test, som ikke blev opfundet som et alternativ til noget andet. At dolkhalens blod koagulerer ved kontakt med endotoxiner blev beskrevet allerede i 1885. Tidligere (i 1865) havde man opdaget, at injektioner af forskellige opløsninger, inklusive destilleret vand, gav feber hos hunde. 1916-1923 blev det påvist, at injiceret pyrogen (endotoxiner) gav feber hos kaniner. 1942-1943 udarbejdedes den pyrogentest på kaniner, som siden er blevet standard.

LAL-testen blev beskrevet i sine hovedtræk i 1964, men det tog 20 år, før den blev helt accepteret at Food and Drug Administration (FDA) i USA som et alternativ til pyrogentest på kanin. FDA’s endelige retningslinjer for, hvorledes LAL-testen skal udføres kom i 1987. Alligevel benyttes der i dag fortsat kaniner i pyrogentests.

*Endotoxin: Giftstof, der findes inde i bakterierne (især de gramnegative)og først frigøres ved disses død.

Sådan foregår pyrogentesten:
Til pyrogentesten anvendes overvejende kaniner.
Inden kaninerne kan indgå i pyrogentesten, skal de optrænes til at sidde i gabestokken i flere timer ad gangen. Optræningen foregår over et par uger.
Det er vigtigt, at kaninerne er vant til turen i gabestokken, da uventede lyde, bevægelser o.lign. kan fremkalde en pludselig feberstigning og skabe panik hos én eller flere kaniner. Når kaninerne bliver angste gør de pludselige, voldsomme bevægelser med kroppen eller krummer hojt skrigende ryggen i et forsøg på at komme fri. Herved brækker de meget nemt ryggen, som er kaniners "svage punkt".
Alt efter hvor meget insulin der skal testes, kan antallet af kaniner variere fra 10 til 50 om dagen.
Da kaninerne skal have nogle dages pause efter forsøget for at få giftstoffet ud af blodet, eller nogle ugers pause, hvis der er konstateret feberfremkaldende urenheder, siger det sig selv, at de store medicinalfirmaer har mange kaniner opstaldet. Der skal hele tiden være nogen klar til brug.

Med henblik på den rette dosering, vejes dyrene om morgenen. Så fikseres de i gabestokkene, d.v.s. en slags kasse, der er åben foroven og bagtil, men lukket på siderne. Foran er der en rundet neddybning til kaninernes hals og derover en bøjle, som lukkes ned over halsen.
Kaninerne er nu parate til blodprøvetagning og indsprøjtning, som foretages i ørerne. Forinden skal kaninerne dog have en føler, et termometer op i endetarmen.
Føleren fastholdes ved at der vikles ståltråd el.lign. omkring føler og hale. Føleren er elektrisk forbundet med et apparat, der løbende registrerer kaninens legemstemperatur, som normalt ligger omkring 39°C. Er dyrepasseren dårlig til sit arbejde, eller uden fornemmelse for, at det er levende væsener han har med at gøre, kan kaninerne være ømme og røde bagi.
Insulinen injiceres herefter i kaninen. Får kaninen feber, er insulinen ikke ren. Kaninen sidder gennemsnitlig i 6-7 timer pr. dag i gabestokken. I denne periode tilbydes de hverken mad eller vand. Kaninerne placeres i gabestokken mellem kl. 7 og 8 om morgen, og køres ind i et testrum.
Da rengøring og fodring som regel først foretages herefter, når kaninerne sjældent at spise inden de sættes i gabestok. Kaninerne har ikke fået foder siden morgenen dagen før, altså 24 timer før.
Sammenlagt med de 6-7 timer de nu tillige tilbringer i gabestokken, når kaniner altså op på ialt ca. 30 timer uden foder. Dette er meget almindeligt for kaniner der indgår i pyrogentesten!